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昆明植物所闡明天然稀有弩箭子糖的生物合成機制

2020-04-08 昆明植物研究所
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  天然糖類是活性天然產物的一個重要結構單元,糖苷化修飾有利于提高活性分子的生物相容性及靶點識別的特異性,迄今許多臨床一線使用的藥物如紅霉素、阿霉素及萬古霉素等都是糖苷類化合物。弩箭子糖(antiarose)是一類六碳脫氧糖,最初于1896年由水解劇毒木本植物見血封喉樹汁液中的天然毒素——α-弩箭子甙(α-antiarin)得到。據報道,目前大約有50多種強心苷類化合物中含有弩箭子糖結構,這一類強心苷類化合物對Na+/K+-腺苷三磷酸酶或者是人腫瘤細胞系具有納摩爾級的抑制活性,它們在心力衰竭、房性心律失常和癌癥的治療方面具有重要的臨床應用價值。除上述強心苷外,弩箭子糖這一不常見的天然結構僅存在于少數幾個天然產物中,且目前弩箭子糖的生物合成機制尚不清楚。

  2016年初,中國科學院昆明植物研究所天然藥物化學前沿交叉團隊黃勝雄研究組闡明了托酚酮吡啶生物堿類化合物rubrolones生物合成過程涉及二型聚酮合酶和氧化酶介導的復雜氧化重排形成托酚酮環的化學機制(Org. Lett. 2016, 18, 1254)。隨后通過該研究組對rubrolones的生物合成途徑作了進一步的詳細解析,闡明了自然界普遍存在非酶催化的吡啶環生物合成機制 (Nat. Commun. 2016, 7, 13083)

  最近,該課題組在前期生物合成解析基礎上,對其糖配體的關鍵基因進行了深入研究。通過系列體外酶學實驗證實了rubrolones中糖配體關鍵基因RubS3-S5的作用邏輯,并運用波譜學方法確定了酶RubS3作用后的產物為TDP-D-antiarose (4)。分析酶RubS3體外反應的底物TDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose (1)和產物TDP-D-antiarose (4)的結構差異,對酶RubS3可能的催化機制提出了三種假設 (1, 機制 ABC)。隨后,通過設計系列氘原子標記的體外酶學實驗探索了酶RubS3的作用機理,初步發現它通過推測的機理C產生作用,即NADPH4S-H傳遞到C-4位羰基,完成羰基的還原,溶劑中的質子傳遞到C-3位,經烯醇中間體完成C-3位的異構,從而形成產物TDP-D-antiarose (4)。酶RubS3由此被鑒定為一類新型的還原-異構雙功能酶,系統發育分析發現rubterolone生物合成基因簇中的酶RblE與之有較高的相似性。后續的體外酶學實驗證實酶RblE也能將底物TDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose轉化為產物TDP-D-antiarose,且與酶RubS3具有相似的米氏動力學參數。序列比對發現酶RubS3具有短鏈脫氫/還原酶中的活性催化三聯體Thr111-Tyr135-Lys139。據此,使用點突變的方法構建了酶RubS3的三種突變蛋白(T111V, Y135F K139A),體外酶學實驗發現上述突變蛋白的催化活性較野生型蛋白顯著降低或完全消失,但有關酶RubS3堿性殘基的突變的一系列蛋白突變體卻沒有表現出催化能力的改變,暗示酶RubS3作用時C-3位羥基的異構可能經由一種潛在的新機制完成。

  上述研究內容表明,RubS3RblE是一類新型的還原-異構雙功能酶,它們均通過圖2所示的機制催化自然界中稀有弩箭子糖的生物合成。這一類酶的發現解決了百年來懸而未決的有關自然界中弩箭子糖如何形成的科學問題,為后期利用相關組合生物合成和合成生物學手段擴充天然糖苷化合物的結構多樣性奠定了基礎。

  該研究成果以Biosynthetic access to the rare antiarose sugar via an unusual reductase-epimerase 為題在線發表于國際期刊Chemical Science。上述研究工作得到國家自然科學基金-云南省聯合基金重點項目(U1702285)、國家合成生物學重點研發計劃、中科院青年創新促進會專項、云南省人才專項和應用基礎研究計劃等資助。

  文章鏈接

1. RubS3將底物1轉化為產物4的三種可能機制

2. RubS3可能的催化機制

打印 責任編輯:葉瑞優

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